جدا سازی و تعیین ویژگی های سلولهای بنیادی مغز استخوان انسان و تمایز به رده سلولهای کبدی در محیط آزمایشگاه

امروزه، پیوند کبد تنها راه درمان اختلالات و بیماری های حاد و مزمن کبدی در مراحل پیشرفته آنست. با توجه به مشکلات متعدد موجود در مسیر عمل پیوند و با توجه به پتانسیل بالای سلول های بنیادی به عنوان منبع مناسب سلولی قابل پیوند در پزشکی ترمیمی، پژوهشگران به یافتن راهکار های نوین جهت استفاده از این سلول ها در درمان بیماری های کبدی پرداخته اند. از آنجایی که کاربرد بالینی سلول های بنیادی جنینی با وجود قدرت تزاید و تمایز به لحاظ وجود مشکلات ومحدودیت های اخلاقی پیشرفت چندانی نداشته است، در این پروژه امکان استفاده از سلول های بنیادی بالغ مورد توجه قرار گرفت. کلیه روش های مربوط به مرحله اول این تحقیق از جمله جداسازی، کشت، تعیین هویت و تمایز سلول های بنیادی مزانشیم (mesenchymal stem cells) (msc) به سلول های شبه کبدی ابتدا با استفاده از سلول های msc مغز استخوان موش بزرگ آزمایشگاهی راه اندازی و پس از کسب نظر موافق کمیته اخلاق و اهداکنندگان، به نمونه انسانی تعمیم داده شد. روش های مختلف جداسازی سلول ها، بررسی استفاده از محیط های کشت با میزان قند و سرم مختلف و تغییر زمان اولین تعویض از جمله فاکتورهایی بود که در رابطه با بهینه سازی شرایط جداسازی، کشت وتکثیر سلول هایmsc مد نظر قرار گرفت. تعیین هویت سلول های msc با استفاده از آنالیز مارکر های سطحی توسط فلوسیتومتری و بررسی توان تمایزی این سلول ها به سلول های رده استخوانی و سلول های بافت چربی صورت گرفت. القاء تمایز به سلول های کبدی با استفاده از یک پروتکل جدید دو مرحله ای و در سه گروه سلولی انجام شد. با توجه به این که علی رغم نقش مهم فاکتور رشد انسولین (igf-i)، مطالعه مدونی در ارتباط با تاثیر این فاکتور در تمایز سلول های بنیادی به سلول های شبه کبدی گزارش نشده بود، با هدف بررسی و بهبود کشت و تمایز سلول های بنیادی مغز استخوان انسانی به سلول های شبه کبدی از این فاکتور بعنوان یکی از عوامل ضروری القاء تمایز کبدی استفاده کردیم. نتایج حاصل از آزمایشات مختلف در گروه های تحت بررسی نشان داد که درگروه های تحت تیمار با فاکتور igf-i در مقایسه باگروه فاقد این فاکتور از نظر مورفولوژیک و عملکرد (ترشح آلبومین) بطور معنی داری بهبود یافته است (0.05 p?). یافته های حاصل ازمطالعات ایمونوسیتوشیمی و رنگ آمیزی های اختصاصی حاکی از بیان مارکرهای اختصاصی کبدی مانند آلبومین، آلفافیتوپروتئین و ذخیره گلیکوژن در سیتوپلاسم این سلولها بود. ترشح اوره از سلولهای تحت تیمار با فاکتور igf-i نسبت به سلولهای تمایز یافته در محیط فاقد igf-i بیشتر بوده است و در مقایسه با نمونه کنترل افزایش معنی دار نشان داد (p< 0.001) . ضمنا از آنجا که ژن sox17 از دسته فاکتورهای نسخه برداری کلیدی در مراحل تکوین کبد جنین، تشکیل اندودرم، و تمایز سلول های پیش ساز به سلول های کبدی است، در این طرح به مطالعه مولکولی و امکان تهیه و کلون سازی این ژن و دست ورزی ژنتیکی آن به منظور بیان در وکتور های لنتی ویروس نیز پرداختیم. در این مطالعه ضمن تلاش در بهبود بخشیدن روش های موجود در جداسازی و کشت سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسانی، برای اولین بار با استفاده از فاکتورigf-i به عنوان یکی از فاکتور های تکمیل کننده محیط تمایزی کبدی به نتایج بهتری از نظر مورفولوژی و عملکرد سلول های تمایز یافته رسیدیم. نهایتا وکتور لنتی ویروس بیانگر ژن sox17 تهیه شد که از فاکتور های مهم رونویسی در تمایز کبدی گزارش شده است.